Il botulismo è una malattia rara ma grave causata da un batterio chiamato Clostridium botulinum, che si trova nel suolo. Produce una tossina neurotropica. Ci sono tre tipi di botulismo: botulismo alimentare, botulismo delle ferite e botulismo infantile. Il botulismo di origine alimentare deriva dal consumo di alimenti contaminati dalla tossina. Le ferite infettate da batteri produttori di tossine provocano il botulismo delle ferite. E il botulismo infantile si verifica quando le spore di C. botulinum germinano e producono la tossina nel tratto gastrointestinale dei bambini consumando i batteri, di solito dal miele. Tutte queste tre forme di botulismo possono essere mortali e sono emergenze mediche.

C. botulinum è un batterio anaerobico, Gram-positivo, a forma di spora che produce la tossina botulinica. La tossina botulinica è una delle tossine più potenti conosciute (circa un microgrammo è letale per l’uomo) che causa la grave malattia neuroparalitica. Ci sono sette tipi sierologicamente distinti di neurotossina botulinica – i tipi A, B, C, D, E, F, e G1. Il confronto delle sequenze 16S rRNA ha mostrato che i ceppi di C. botulinum formano quattro cluster distinti che corrispondono a quattro gruppi fisiologici (I-IV), che hanno supportato lo schema di classificazione storico basato su parametri biochimici e biofisici2. I ceppi del gruppo I (C. botulinum proteolitico) producono una o talvolta due tossine di tipo A, B o F; i ceppi del gruppo II (C. botulinum non proteolitico) producono tossine di tipo B, E o F; i ceppi del gruppo III producono tossine di tipo C o D; e i ceppi del gruppo IV producono tossine di tipo G3,4.

La neurotossina botulinica di tipo A (BoNT/A) è il sierotipo BoNT più studiato e meglio caratterizzato. Un’indagine della letteratura scientifica indica che ci sono circa tre volte più pubblicazioni sul BoNT/A rispetto al sierotipo successivo più frequente, BoNT/B5. Negli Stati Uniti dal 2001 al 2007, un totale di 139 casi di botulismo di origine alimentare sono stati riportati ai Centers for Disease Control and Prevention (CDC). La maggior parte di questi casi sono stati causati da intossicazione da BoNT/A (76 casi) o BoNT/E (46 casi), con solo 10 casi direttamente collegati al consumo di cibo contaminato con BoNT/B. Tuttavia, durante lo stesso periodo, il BoNT/B è stato l’agente causale di 387 dei 663 casi di botulismo infantile (58,4%) registrati dal CDC6.

La tossina botulinica agisce bloccando la funzione nervosa e porta alla paralisi respiratoria e muscoloscheletrica. In particolare, la tossina agisce bloccando la produzione o il rilascio di acetilcolina nelle sinapsi e nelle giunzioni neuromuscolari. La morte si verifica a causa dell’insufficienza respiratoria. I sintomi includono visione doppia, visione offuscata, palpebre cadenti, discorso confuso, difficoltà di deglutizione, bocca secca e debolezza muscolare. In tutti i casi la malattia è causata dalla tossina prodotta dal C. botulinum, non dal batterio stesso. I medici possono considerare la diagnosi di botulismo se la storia del paziente e l’esame fisico suggeriscono il botulismo. Tuttavia, questi indizi spesso non sono sufficienti per consentire una diagnosi. Altre malattie come la sindrome di Guillain-Barré, l’ictus e la miastenia gravis possono apparire simili al botulismo, e possono essere necessari test speciali per escludere queste altre condizioni. Questi test possono includere la scansione del cervello, l’esame del liquido cerebrospinale, il test di conduzione nervosa (elettromiografia, o EMG), e un test al cloruro di edrofonio (Tensilon) per la miastenia gravis.

Una diagnosi definitiva può essere fatta se la tossina botulinica viene identificata nel cibo, nello stomaco o nel contenuto intestinale, nel vomito o nelle feci. La tossina si trova occasionalmente nel sangue nei casi acuti. La tossina botulinica può essere rilevata con una varietà di tecniche, compresi i test immunosorbenti legati agli enzimi (ELISA), i test elettrochemiluminescenti (ECL) e le prove di inoculazione o alimentazione nei topi. Le tossine possono essere tipizzate con test di neutralizzazione nei topi. Nel botulismo tossico-infettivo, l’organismo può essere coltivato da tessuti. Su un terreno di tuorlo d’uovo, le colonie che producono tossine di solito mostrano un’iridescenza superficiale che si estende oltre la colonia. Questi test diagnostici sono menzionati in letteratura, ma non sono facilmente disponibili in India. La mancanza di disponibilità di kit diagnostici commerciali come ELISA, la mancanza di un impianto di coltura anaerobica nella maggior parte degli ospedali e delle strutture private, nonché le difficoltà tecniche ed etiche di fare il test di neutralizzazione nei topi rendono la conferma della diagnosi di botulismo molto impegnativa.

Per indagare su casi sospetti di focolai di botulismo in India, poiché non erano disponibili kit ELISA, abbiamo fatto ricorso al test di neutralizzazione del topo e a test molecolari come la PCR7. Tuttavia, l’antitossina botulinica necessaria per fare i test di neutralizzazione nei topi non è facilmente disponibile e un gran numero di topi sarà necessario per fare questo test. Poiché questi test non sono test diagnostici di routine, il costo coinvolto e le formalità richieste per indentare i topi ritardano i risultati.

I test molecolari non possono rilevare la tossina ma possono rilevare solo i geni BONT se l’organismo può essere coltivato. I geni BONT possono anche essere direttamente amplificati da campioni alimentari e clinici se gli organismi vi sono ancora presenti.

Siccome la tossina botulinica è un importante agente bioterroristico, c’è un bisogno urgente di sviluppare test diagnostici interni. L’articolo di Jain et al8 pubblicato in questo numero aveva lo scopo di sviluppare un sistema di immunodetenzione per la neurotossina botulinica di sierotipo B usando un approccio genico sintetico. È stato sviluppato un test ELISA per il rilevamento della neurotossina botulinica ed è stato anche stimato il limite minimo di rilevamento. L’anticorpo specifico BoNT/B ricombinante è stato utilizzato per catturare l’antigene. I risultati hanno mostrato che il BoNT/B ricombinante potrebbe essere rilevato fino a una concentrazione di circa 15 ng/ml. L’ELISA è una tecnica potenziale che può sostituire il biotest. Il sistema ELISA sviluppato era altamente specifico, rapido e poteva essere applicato all’analisi di un gran numero di campioni.

Prima Scotcher et al5 hanno riportato il sandwitch ELISA per la rilevazione della tossina BoNT/A usando anticorpi monoclonali specifici con buona sensibilità e specificità. Vari formati ELISA sono stati sviluppati utilizzando substrati fluorescenti o chemiluminescenti per migliorare la sensibilità del test 10-100 volte, ma richiedono attrezzature più specializzate9. Sono stati sviluppati diversi test rapidi, sensibili e specifici come la PCR in tempo reale, la PCR immunitaria, ecc. per il rilevamento delle cellule di C. botulinum e dei geni della neurotossina. Il nostro gruppo10 descritto un multiplex PCR per il rilevamento simultaneo di neurotossina botulinica e tossina perfringens geni. Questi metodi, tuttavia, possono essere resi disponibili solo nei centri di riferimento. Pertanto, ELISA sviluppato da Jain et al8 è un passo importante verso la diagnosi rapida della tossina botulinica in campioni alimentari e clinici.

Il numero di casi di botulismo alimentare e infantile è cambiato poco negli ultimi anni, ma il botulismo delle ferite è aumentato a causa dell’uso di eroina black tar, soprattutto in California11. Anche se la tossina botulinica viene distrutta da una cottura accurata nel corso di pochi minuti, la spora stessa non viene uccisa dalla temperatura raggiunta con la normale bollitura a livello del mare, lasciandola libera di crescere e produrre la tossina quando le condizioni sono giuste. L’unica misura di prevenzione conosciuta per il botulismo infantile è quella di evitare di nutrire con il miele i bambini con meno di 12 mesi di età. Il trattamento può includere antitossine, cure mediche intensive o chirurgia delle ferite infette. Pertanto, una diagnosi tempestiva può salvare la vita.

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